Après avoir éprouvé lors d’une première étape en 2013, les capacités techniques de collecteurs de salive disponibles sur le marché, l’équipe du département toxicologie de l’IRCGN a mis au point en 2014, une méthode de recherche et de dosage des principaux stupéfiants et de leurs métabolites dans la salive par CLHP/SM². L’objectif était de développer une méthode suffisamment sensible au regard des recommandations internationales (SAMSHA, DRUID), robuste, simple et rapide pour l’ensemble des substances concernées et décelables dans la salive. Nous proposons ainsi de décrire les principales étapes, contraintes et difficultés qui ont jalonné cette mise au point.

Suite à la précédente étude, les échantillons de travail ont consisté en de la salive diluée au quart dans le tampon de conservation Quantisal™ et dopée par une solution de 31 stupéfiants et métabolites. Dans une première approche, les échantillons étaient analysés sans plus de préparation que l’ajout d’étalons internes et une filtration à 0,45 μm. Actuellement, le traitement des échantillons est basé sur l’extraction liquide/liquide (ELL) de 1 mL de salive tamponnée à pH 9 (K₂HPO₄, 1 M) par un mélange ternaire de solvants. La phase organique additionnée de méthanol acidifié à 0,1 % est évaporée ; le résidu sec est repris par 75 μL d’un mélange acétonitrile/eau (2/3, V/V). Il est analysé selon 2 méthodes différentes avec une CLHP Agilent Technologies^© LC 1260 couplée à un SM AbSciex^© QTRAP^® 4500 équipé d’une colonne Restek^© Allure^® PFP Propyl 3 μm, 50 × 2,1 mm. Les analytes sont élués selon un gradient de phases mobiles (acétonitrile/eau acidifiée) associé à un gradient de débit (0,5 à 1 mL/min) ; les ions positifs et négatifs formés par l’électrospray (ESI) sont détectés en mode MRM (algorithme « Scheduled MRM™ »). Les substances sont identifiées selon leur temps de rétention et le ratio des deux transitions MRM.

Validée selon nos habitudes (détermination du profil d’exactitude avec le logiciel e-noval^® 3.0, Qualilab^©), la méthode après injection directe présentait des limites de quantification inférieures hétérogènes : au mieux de 0,6 ng/mL pour la norkétamine par exemple, mais de seulement 25 ng/mL pour le THC. Par delà ce problème de sensibilité, elle manquait surtout de robustesse en raison d’une interaction entre la matrice et la colonne. Ainsi, une méthode alternative basée sur une ELL unique et deux analyses distinctes a été développée. La première analyse aboutit au dosage de l’ensemble des analytes quand la seconde se focalise sur les cannabinoïdes en faibles concentrations. Cette stratégie nécessite l’emploi d’un système d’étalonnage interne double, haute et basse concentrations. À pH 9, le mélange dichlorométhane/hexane/acétate d’éthyle (50/40/10, V/V/V) s’est révélé le plus polyvalent et, pour le THCCOOH, l’un des plus efficaces parmi les trois solutions d’extraction testées (rendement de 110 % contre 102 % et 84 % pour une matrice surchargée à 10 ng/mL). Lors de cette phase, l’évaluation des cannabinoïdes a été perturbée en raison d’une trop forte acidification qui a provoqué vraisemblablement la cyclisation du CBD en THC. Enfin, si la reprise du résidu sec par un mélange plus riche en acétonitrile que la phase initiale n’a pas eu de conséquence sur l’analyse des substances d’intérêt et en particulier sur la chromatographie, cela a provoqué un gain de sensibilité notable pour les cannabinoïdes (signal pour le THC à 230±9 % par rapport à la reprise par la phase mobile initiale).

Au terme de ce développement, la stratégie analytique retenue permet le dosage des principaux stupéfiants et métabolites de 0,2 à 1500 ng/mL de salive à l’exception de la buprénorphine et des cannabinoïdes de 0,1 à 750 ng/mL, dont le THCCOOH de 0,02 à 30 ng/mL. Malgré une étape de préparation plus longue que prévue, le temps opérateur reste acceptable pour cette méthode qu’il convient maintenant de confronter à de réelles salives issues d’usagers.