A sensitive and rapid method for quantitation of Sofosbuvir in human plasma has been established using ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS).

Sofosbuvir d3 was used as an internal standard. Sofosbuvir and internal standard in plasma sample were extracted using ethyl acetate (liquid liquid extraction). A centrifuged upper layer was then evaporated and reconstituted with the mobile phase of 0.5% formic acid: methanol (30:70, v/v). The reconstituted samples were injected into a Gemini C18 (50×4.6mm, 5μm) column.

Using MS/MS in the multiple reaction monitoring mode, Sofosbuvir and Sofosbuvir d3 were detected without severe interferences from human plasma matrix. Sofosbuvir produced a protonated precursor ion ([M+H]⁺) at m/z 428.35 and a corresponding product ion at m/z 279.26. The internal standard produced a protonated precursor ion ([M+H]⁺) at m/z 431.38 and a corresponding product ion at m/z 282.37. The calibration curves for the analyte was linear (R²≥0.9956, n=4) over the concentration range of 4.063–8000.010ng/mL. Stability studies revealed that Sofosbuvir was stable in plasma during bench top (7h at room temperature), in injector (20h), at the end of five successive freeze and thaw cycles and long term at −70°C±15°C for 15 days.

The developed method was validated as per the guidelines of USFDA and the obtained results were found to be within the limits and could be successfully employed for the determination of Sofosbuvir in human plasma for regular and pharmacokinetic studies.

Une méthode sensible et rapide pour la quantification du Sofosbuvir dans le plasma humain a été établie en utilisant une chromatographie en phase liquide à ultra performance, par spectrométrie de masse en tandem par ionisation par électrospray (UPLC–ESI–MS/MS).

Sofosbuvir d3 a été utilisé comme standard interne. Sofosbuvir et standard interne dans les échantillons plasmatiques ont été extraits à l’aide d’acétate d’éthyle (extraction liquide-liquide). Une couche supérieure a été centrifugée puis évaporée et reconstituée avec la phase mobile constituée de 0.5 % d’acide formique: méthanol (30:70, v/v). Les échantillons reconstitués ont été injectés dans une colonne Gemini C 18 (50×4,6mm, 5μm).

En utilisant la MS/MS dans le mode de surveillance multiples, Sofosbuvir et Sofosbuvir d3 ont été détectés sans interférence à partir de plasma humain matrice. Sofosbuvir produit un ion précurseur protoné ([M+H]⁺) en m/z 428.35 et un produit correspondant à l’ion m/z 279.26. L’étalon interne produit un ion précurseur protoné ([M+H]⁺) en m/z 431.38 et un produit correspondant à l’ion m/z 282.37. La courbe d’étalonnage pour l’analyte est linéaire (r² ≥0.9956, n=4) pour des concentrations allant de 4,063 à 8000,010ng/mL. Des études ont révélé que le sofosbuvir était stable dans le plasma après conservation durant 7h sur paillasse, dans l’injecteur (20h), à la fin des cinq cycles de congélation et décongélation successifs et à long terme à −70° C±15°C pour 15heures.

La méthode mise au point a été validée selon les lignes directrices de l’USFDA et les limites se situaient dans les normes et pourrait être employée avec succès pour la détermination du sofosbuvir dans le plasma humain pour des études de pharmacocinétiques.