Insulin exerts its biological effects through a plasma membrane receptor that possesses a tyrosine-kinase activity. This tyrosine-kinase activity depends on the autophosphorylation of the receptor on tyrosine residues and on its dephosphorylation by protein tyrosine-phosphatases. The discovery of pharmacological agents that specifically stimulate the autophosphorylation of the insulin receptor or inhibit its dephosphorylation will be of great importance for the treatment of insulin resistant or insulin deficient patients.

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) has developed in recent years as a new technique to study protein-protein interactions. In the BRET technique, one partner is fused to Renilla luciferase, whereas the other partner is fused to a fluorescent protein (e.g. YFP, Yellow Fluorescent Protein). The luciferase is excited by addition of its substrate, coelenterazine. If the two partners interact, resonance energy transfer occurs between the luciferase and the YFP, and a fluorescent signal, emitted by the YFP, can be detected. Our work indicates that this methodology could be an important tool for the search of molecules that activate insulin receptor autophosphorylation or that inhibit its dephosphorylation. Indeed, we first showed that the activation of the insulin receptor by different ligands can be monitored using a chimeric receptor with one ß-subunit fused to Renilla luciferase and the other ß-subunit fused to YFP. The conformational changes induced by different ligands could be detected as an energy transfer (BRET signal) between the luciferase and the YFP, that reflects the activation state of the receptor. This methodology allows for rapid analysis of the effects of agonists on insulin receptor activity and may therefore be used in high-throughput screening for the discovery of molecules with insulin-like properties. More recently, we demonstrated that the BRET methodology could also be used to monitor the interaction of the insulin receptor with protein tyrosine-phosphatase 1B, one of the main tyrosine-phosphatase that controls its activity. HEK cells were co-transfected with the insulin receptor fused to Renilla luciferase and a substrate-trapping mutant of PTP1B (PTP1B-D181A) fused to YFP. Insulin-induced BRET signal could be followed in real time for more than 30 min. Therefore, this methodology can also be used in high-throughput screening for the search of molecules that will specifically disrupt the interaction between the insulin receptor and PTP1B.

L'insuline exerce ses effets biologiques grâce à un recepteur membranaire qui possède une activité tyrosine kinase. Cette activité tyrosine-kinase dépend de l'autophosphorylation du récepteur sur résidus tyrosines et de sa déphosphorylation par des protéines tyrosine-phosphatases. La découverte d'agents pharmacologiques qui stimuleraient spécifiquement l'autophosphorylation du récepteur ou qui inhiberaient sa déphosphorylation pourrait avoir des conséquences importantes pour le traitement de patients insulino-résistants ou insulino-déficients. La technique de BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) est apparue ces dernières années comme un nouvelle technique permettant d'étudier les interactions protéine-protéine de façon dynamique. Dans la technique de BRET, un des partenaires est fusionné à une luciférase ( Renilla luciférase), tandis que l'autre partenaire est fusionné à une protéine fluorescente (e.g. YFP, Yellow Fluorescent Protein). La luciférase est excitée par addition de son substrat, la coelentérazine. Si les deux partenaires interagissent, un transfert d'énergie se fait par résonance, de la luciférase vers la YFP, et un signal fluorescent, émis par la YFP, peut être détecté. Notre travail indique que cette méthodologie pourrait être un outil important pour la recherche de molécules qui activent l'autophosphorylation du récepteur de l'insuline ou qui inhibent sa déphosphorylation. En effet, nous avons tout d'abord montré que l'activation du récepteur de l'insuline par différents ligands peut être mesurée en utilisant un récepteur chimérique dans lequel une des sous-unités ß est fusionnée à la luciférase et l'autre sous-unité ß est fusionnée à la YFP. Nous avons montré que les changements de conformations induits par différents ligands produisent un signal de BRET qui est un reflet fidèle de l'état d'activation du récepteur. Cette méthode permet d'analyser très rapidement l'effet d'agonistes du récepteur de l'insuline et pourrait donc être utilisée dans des tests de criblage à haut débit pour la recherche de molécules ayant des propriétés insulino-mimétiques. Plus récemment, nous avons également montré que la technique de BRET peut être utilisé pour suivre l'interaction entre le récepteur de l'insuline et une des principales tyrosine-phosphatase qui contrôlent son activité, la protéine tyrosine-phosphatase PTP1B. Cette interaction a été étudiée dans des cellules HEK co-exprimant le récepteur de l'insuline fusionné à la luciférase et une forme “piège à substrat” de PTP1B (PTP1B-D181A) fusionnée à la YFP. Dans ces expériences, l'effet de l'insuline sur l'interaction entre le récepteur et PTP1B pouvait être suivi en temps réel, dans des cellules vivantes, pendant plus de 30 min. Cette méthodologie pourrait également être utilisée dans des tests de criblage à haut débit pour la recherche de molécules qui inhiberaient spécifiquement l'interaction entre le récepteur de l'insuline et PTP1B.