16S rRNA gene-based cultivation-independent methods are increasingly used to study the diversity of microbiota during health and disease. One bias of these methods is the variability of 16S rRNA gene that may exist among strains of a same species (intraspecific heterogeneity) or between rrs copies in a genome (intragenomic heterogeneity). We evaluated the level of intraspecific and intragenomic 16S rDNA variability in seven species frequently encountered in respiratory tract samples in cystic fibrosis (CF). A total of 179 strains were subjected to V3 region 16S rDNA PCR-TTGE. Using this easy-to-perform and rapid method, different levels of V3 region rrs heterogeneity were demonstrated. No intraspecific and intragenomic rrs heterogeneity was demonstrated for Moraxella catarrhalis (n=16), Pseudomonas aeruginosa (n=31) and Streptococcus pneumoniae (n=14) showing a single PCR-TTGE band characteristic of the species. Low level of intraspecific heterogeneity was observed for Staphylococcus aureus (n=30), Stenotrophomonas maltophilia (n=29) and Achromobacter xylosoxidans (n=28), and 17%, 38% and 96% of these strains showed intragenomic heterogeneity (two to four different rrs copies), respectively. Haemophilus influenzae (n=31) displayed the higher level of intraspecific variability with 23 different PCR-TTGE patterns and 61% of the strains showed intragenomic rrs heterogeneity (two to four different rrs copies). Although only one hypervariable region of the 16S rRNA gene was explored, intraspecific and intragenomic rrs heterogeneity was frequently observed in this study and should be taken into consideration for a better interpretation of 16S rRNA gene-based diversity profiles in denaturing gels and to avoid any overestimation of the respiratory microbiota diversity in CF.

La PCR ADNr 16S-Temporal Temperature gradient Gel Electrophoresis (TTGE) est une technique indépendante de la culture permettant l’étude de communautés bactériennes normales et pathologiques. Une de ses limites est la variabilité de l’ADNr 16S pouvant exister entre souches d’une même espèce (intraspécifique) ou entre différentes copies génomiques dans une même souche (intragénomique). Le but de cette étude est d’évaluer les niveaux d’hétérogénéité de l’ADNr 16S chez sept espèces bactériennes isolées des voies respiratoires au cours de la mucoviscidose. Un total de 179 souches a été étudié. Après extraction de l’ADN total et amplification de la région V3 de l’ADNr 16S, les amplicons sont séparés par TTGE. Par cette technique simple et rapide, différents niveaux d’hétérogénéité ont été démontrés. Les souches de Moraxella catarrhalis (n=16), Pseudomonas aeruginosa (n=31) et Streptococcus pneumoniae (n=14) présentent une bande unique, spécifique d’espèce, témoignant de l’absence de variabilité de l’ADNr 16S. Pour Staphylococcus aureus (n=30), Stenotrophomonas maltophilia (n=29) et Achromobacter xylosoxidans (n=28), un faible niveau de diversité intraspécifique est observé et respectivement, 17 %, 38 % et 96 % des souches possèdent des hétérogénéités intragénomiques (profils de deux à quatre bandes). Enfin, pour Haemophilus influenzae (n=31), un très fort niveau de variabilité intraspécifique est mis en évidence (23 profils différents) et 61 % des souches présentent de deux à quatre copies différentes de la région V3. Cette étude montre que le polymorphisme intraspécifique et intragénomique de l’ADNr 16S est un phénomène fréquent qu’il est important d’étudier afin de mieux interpréter les résultats des études indépendantes de la culture basées sur la séparation en gel dénaturant, en particulier pour l’étude des communautés bactériennes respiratoires au cours de la mucoviscidose.