Nous décrivons une nouvelle méthode colorimétrique pour déterminer le phénotype de l'ADN polymérase du cytomégalovirus humain (CMV) en mesurant l'incorporation de nucléotides marqués à la digoxigénine dans le brin d'ADN en cours de synthèse. La mutation N495K et l'association des mutations K415R et S291P, observées sur des isolats cliniques résistants au foscarnet ont été étudiées. Les mutations V715M et E756K, connues pour conférer une résistance au foscarnet, ont été choisies comme témoins. Toutes les mutations ont été introduites par mutagenèse dirigée dans le gène UL54 de la souche de référence Towne, préalablement cloné dans un vecteur d'expression. Les polymérases mutées et sauvages ont été synthétisées dans un lysat de réticulocytes à l'aide d'une trousse de transcription-traduction couplée in vitro. L'activité polymérase a été mesurée en présence et en absence de foscarnet. Les concentrations de foscarnet inhibant de 50 % l'activité des polymérases portant la mutation V715M ou E756K sont respectivement 70 et 30 fois supérieures à celle inhibant l'activité de la souche de référence sensible. Les modifications N495K et l'association S291P et K415R induisent une diminution de la sensibilité de la polymérase au foscarnet. Les résultats obtenus avec le test colorimétrique concordent avec ceux obtenus par la technique en radioactivité habituellement utilisée. Cette nouvelle méthode phénotypique pourrait être utile pour caractériser les mutations du gène de l'ADN polymérase du CMV susceptibles de conférer une résistance au foscarnet.

We described a colorimetric method to determine the biochemical phenotype of wild-type and mutated cytomegalovirus (HCMV) DNA polymerases by measuring the incorporation of digoxigenin-labelled nucleotides into the growing DNA chain. Mutations V715M and E756K, which are known to confer foscarnet-resistance, were used as controls. Mutation N495K and a combination of changes K415R and S291P, both observed in foscarnet-resistant isolates, were studied. The mutations were introduced by site-directed mutagenesis into wild-type gene UL54 cloned in an expression vector and then polymerases were synthesised by using a commercially available coupled transcription-translation system. The polymerase activity was measured with and without foscarnet. The activity of polymerases containing the V715M or E756K mutations was inhibited by foscarnet at concentrations 70- and 30-fold higher than that of wild-type polymerase, respectively. Change N495K and combination of K415R and S291P, induced a five- and ten-fold decrease in susceptibility to foscarnet, respectively. The results of this non-radioactive assay were consistent with those obtained with the conventional radioactive assay. Therefore, this novel phenotypic method could be useful for the characterisation of mutations that confer HCMV resistance to foscarnet.