To understand the mechanism of allosteric coupling between the ligand-binding domain and the ion channel of the Cys-loop ligand-gated ion channels (LGICs), we fused the soluble acetylcholine-binding protein (AChBP), which lacks an ion channel, to either the cationic serotonin type-3A ion channel (5HT_3A) or the anionic glycine ion channel. Both linear chimeras expressed in HEK-293 cells display high affinity for the nicotinic agonist epibatidine ( ), but are not targeted to the cell surface. Only after substituting a ring of three loops located at the putative membrane side of the AChBP three-dimensional structure by the homologous residues of 5HT_3A, the resulting chimera AChBP(ring)/5HT_3A (i) still displayed on intact cells an apparent high affinity for epibatidine, yet with a fourfold decrease ( ), (ii) displayed a high proportion of low affinity sites (11±7 μM) for the resting state stabilizing competitive antagonist α-bungarotoxin and (iii) was successfully targeted to the cell surface, as seen by immunofluorescence labelling. The AChBP(ring)/5HT_3A chimera forms a pentameric structure, as revealed by sucrose gradient sedimentation. However, no whole-cell patch-clamp currents were detectable. Interestingly, binding assays with membrane fragments prepared from cells expressing AChBP(ring)/5HT_3A showed a decrease in the apparent affinity for the agonists nicotine and epibatidine (5-fold), concomitant with an increase in the proportion of high-affinity sites (48±1 nM) for α-bungarotoxin. These results indicate that fusion of AChBP to an ion channel forms a pentameric receptor exposed to the cell surface and able to convert between discrete allosteric states, but stabilized in a high affinity state for epibatidine that likely corresponds to a desensitized form of LGICs. These artificial chimeras might offer a useful system to investigate signal transduction in LGICs. To cite this article: T. Grutter et al., C. R. Biologies 328 (2005).

Afin de comprendre les mécanismes de couplage entre le domaine de liaison de lʼacétylcholine (ACh) et son canal ionique, nous avons fusionné la protéine soluble liant lʼACh (AChBP) naturellement dépourvue de canal, soit à un canal cationique sérotoninergique (5HT_3A), soit à un canal anionique glycinergique. Ces chimères AChBP/5HT₃ et AChBP/Gly possèdent une haute affinité pour lʼagoniste épibatidine similaire à lʼaffinité pour lʼAChBP soluble, mais ne sont pas adressées à la membrane plasmique. En revanche, en substituant trois boucles localisées sur la face membranaire hypothétique de lʼAChBP par les résidus homologues « sérotonine » dans la chimère AChBP/5HT₃, la chimère correspondante AChBP(ring)/5HT₃ (i) manifeste encore une haute affinité pour lʼépibatidine, avec toutefois une légère baisse dʼaffinité ( ), (ii) présente une forte proportion de sites de basse affinité pour lʼα-bungarotoxine, qui bloque de manière compétitive le récepteur sous lʼétat de repos, et (iii) est adressée à la surface de la cellule. Cette chimère forme un pentamère mis en évidence par des expériences de centrifugation sur gradient de saccharose, mais aucun courant nʼest détecté par électrophysiologie en condition cellule entière. Cependant, en préparant des membranes à partir de cellules transfectées par la chimère AChBP(ring)/5HT₃, nous décrivons une perte dʼaffinité pour les agonistes (5 fois), concomitante à une augmentation des sites de haute affinité pour lʼα-bungarotoxine. Nous en concluons que la chimère forme un pentamère de surface capable dʼeffectuer des transitions allostériques, mais quʼelle est bloquée dans un état de haute affinité pour lʼépibatidine, qui correspond probablement à la forme désensibilisée du récepteur. Pour citer cet article : T. Grutter et al., C. R. Biologies 328 (2005).