Nous proposons une méthode simple et rapide pour la discrimination entre les gènes des β-lactamases à spectre étendu (BLSE) de type SHV chez P. aeruginosa en se basant sur des techniques de PCR (PCR-RFLP et RSI-PCR). Nous avons étudié 22 isolats de P. aeruginosa producteurs de BLSE, isolés de prélèvements cliniques effectués chez sept patients immunodéprimés (19 isolats) et de prélèvements environnementaux (trois isolats) au Centre national de greffe de moelle osseuse de Tunis. L’amplification PCR de screening utilisant des paires d’amorces détectant les gènes codant pour les β-lactamases du groupe TEM, SHV, OXA groupe I, OXA groupe II, OXA-18 et PER-1 a permis l’amplification des gènes bla_OXA18 et bla_SHV parmi toutes ces souches. L’électrophorèse en champ pulsé utilisant l’endonucléase SpeI a identifié cinq groupes génotypiques. La digestion des produits PCR des cinq souches représentatives des différents génotypes par DdeI et BsrI a montré des profils de restriction identiques à celui du témoin négatif bla_SHV-1 ; de même que la digestion des produits de RSI-PCR par NruI, témoignant de l’absence des mutations 35, 238 et 240, caractéristiques des BLSE décrites chez P. aeruginosa (SHV-2a, SHV5 et SHV12) et suggérant que les gènes bla_SHV étudiés ne codaient pas pour des BLSE. L’hybridation de l’ADN génomique par southern blot avec une sonde contenant le gène bla_SHV-1 a été positive avec toutes les souches. Le séquençage du cadre de lecture entier a identifié la séquence comme celle de bla_SHV-1. Les résultats de la PCR-RFLP et de l’RSI-PCR ont ainsi été confirmés. Cette approche est efficace pour le screening des souches de P. aeruginosa hébergeant un gène de BLSE de type SHV lors des études épidémiologiques et pour détecter de nouveaux variants.

We propose a simple and rapid method to discriminate SHV-type extended spectrum β-lactamase (ESBL) genes in P. aeruginosa based on PCR techniques (PCR-RFLP and RSI-PCR). We studied 22 producing ESBL P. aeruginosa strains isolated from seven immunocompromised patients (19 isolates) and from environmental swabs (three isolates) at the Bone Marrow Transplantation Center of Tunis. Screening PCR with primer pairs designed to detect gene encoding TEM, SHV, OXA group I, OXA group II, OXA-18 and PER-1 ESBL was positive for bla_OXA18 and bla_SHV genes in all isolates. Pulsed field gel electrophoresis using SpeI endonuclease defined five genotypic groups. For at least one isolate corresponding to each genotype observed, restriction of PCR products by DdeI and BsrI revealed the same restriction pattern that the bla_SHV-1 negative control; in the same way, RSI-PCR products digestion by NruI, thus excluding 35, 238 and 240 mutations characterizing reported ESBL in P. aeruginosa (SHV-2a, SHV5 et SHV12), and suggesting that studied bla_SHV genes were not ESBL ones. Genomic DNA hybridization by southern blot with probe consisting in bla_SHV-1 gene was positive in these isolates. Sequencing the full-length open reading frame revealed nucleotide sequence of the bla_SHV-1. PCR-RFLP and RSI-PCR results were then confirmed. This approach is effective for screening P. aeruginosa for ESBL genes carriage in epidemiological studies and for detecting new variants.