En 2022 en France métropolitaine, le diagnostic du paludisme d'importation concerne 60 000 personnes pour environ 6000 sujets infectés. Le résultat du diagnostic biologique doit être rendu au service clinique demandeur, dans les deux heures suivant l'arrivée de l'échantillon au laboratoire. Il repose dans un premier temps sur une technique sensible, la goutte épaisse ou la biologie moléculaire. Dans la dernière décennie des trousses commerciales de diagnostic du paludisme en biologie moléculaire, basées sur une amplification isotherme (LAMP), sont disponibles. Elles sont économiquement couteuses et utilisent pour l'essentiel une technologie basée sur la détection de l'ADN produit par turbidimétrie sans possibilité de contrôle de la spécificité.

L'objectif de cette étude est la mise au point d'une méthode de LAMP biplex en temps réel, pour l'identification spécifique de l'ADN de Plasmodium spp, compatible avec le diagnostic d'urgence du paludisme.

Une première étape consiste, à partir de sang total, a extraire le plus rapidement et le mieux possible l'ADN du parasite. Les extraits d'ADN sont ensuite soumis à une amplification par LAMP biplex en temps réel en utilisant d'une part des amorces spécifiques du gène de la cytochrome c oxydase de Plasmodium spp que nous avons optimisés et d'autres part des amorces spécifiques de la béta et un temps de positivité (Tp) est déterminé pour chaque échantillon. Le Tp est exprimé en secondes. Il est fonction de la quantité initiale d'ADN cible.

La technique d'extraction la plus efficiente dénommée « Fast CNRPSL » nous permet d'extraire l'ADN total en moins de 20 mn avec un rendement d'extraction supérieur aux méthodes classiques. L'ADN obtenu peut être utilisé, sans perte d'efficacité, pour l'amplification (PCR ou LAMP). La validation technique de la LAMP biplex en temps réel nous permet de confirmer la spécificité de l'amplification via la mesure du Température de fusion moléculaire (Tm) de l'amplicon. Les coefficients de variation pour la répétabilité et la reproductibilité sont inférieurs à 10%. L'amplification concomitante, d'une portion d'ADN génomique, de la beta-tubuline humaine est efficace pour le contrôle interne d'amplification. L'analyse complète des extraits d'ADN est inférieure à 40 mn. Enfin, cette technique permet d'approcher la quantification de l'ADN mitochondrial Plasmodial.

Notre méthode, extraction d'ADN à partir de sang total « Fast CNRPSL » suivi de la LAMP biplex en temps réel, permet le diagnostic en moins d'une heure de Plasmodium spp. Elle est performante et économique en comparaison des solutions commerciales.

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