L'histopathologie est le gold standard pour différencier colonisation et infection fongique (IF), mais ne permet pas un diagnostic précis de genre et d'espèce. Or, si la culture est négative ou qu'aucun prélèvement n'est adressé au laboratoire de Mycologie, seul le prélèvement adressé au service de Pathologie est disponible. La fixation en formol et l'inclusion en paraffine (FFPE) provoquent des dommages à l'ADN, rendant plus difficile la réalisation de techniques moléculaires. L'objectif de cette étude était de développer, optimiser et évaluer l'intérêt du séquençage massif et parallèle (SMP) fongique sur tissus FFPE.

Une relecture histopathologique de tous les cas a été réalisée. Puis, l'extraction d'ADN issu de tissus FFPE a été optimisée, en : i) macrodisséquant la zone riche en éléments fongiques sur le bloc de paraffine ; ii) comparant l'efficacité de deux kits d'extraction d'ADN (QIAamp DNA micro kit de QIAGEN ; Maxwell 16 LEV RNA FFPE Purification kit de Promega optimisé pour l'extraction d'ADN), par comparaison des résultats de PCR spécifiques Aspergillus fumigatus et Mucorale pour 30 cas. Pour 23 autres cas, dont 22 avec une identification mycologique, la sensibilité de deux couples d'amorces (ITS3/4 et MITS2A/B) a été comparée pour l'identification par séquençage Sanger (pourcentage d'homologie > 97 %) puis SMP. Enfin, une confrontation histo-moléculaire était réalisée. Ce travail a été financé par la Société de Pathologie Infectieuse de Langue Française.

Pour optimiser l'extraction, l'ADN a été extrait par les deux kits à partir de prélèvements issus de 16 mucormycoses et 14 aspergilloses à Aspergillus fumigatus. La sensibilité des PCR était meilleure avec le kit d'extraction de QIAGEN (100 % (30/30)) en comparaison au kit de Promega (86,7 % (26/30)).

Une amplification par PCR de l'ADN fongique issu de 23 autres prélèvements FFPE a été réalisée. Les couples d'amorces ITS3/4 et MITS2A/B, permettaient : i) une détection des produits de PCR sur gel d'électrophorèse dans 100 % (23/23) des cas ; ii) une identification par séquençage Sanger dans 43,5 % (10/23) avec les amorces ITS3/4 et 48 % (11/23) des cas avec les amorces MITS2A/B ; et iii) une identification par couplage SMP-examen histopathologique dans 65,2 % (15/23) pour ITS3/4 et MITS2A/B. De plus, la combinaison des résultats des séquençages Sanger et SMP, réalisés pour chacun des cas, permettait une identification, au minimum jusqu'au genre, dans 73,9 % (17/23) des cas. Au total, l'ajout du SMP au séquençage Sanger permettait d'augmenter la proportion diagnostique de 26 % (6/23).

Le développement du SMP fongique sur tissus FFPE est innovant et inédit, permettant un diagnostic histo-moléculaire de certitude dans 73,9 % des cas, lorsqu'il est couplé au séquençage Sanger et à l'examen histopathologique. Cette technique est utilisable en milieu hospitalier et pourrait améliorer la prise en charge des patients, notamment lorsqu'aucun prélèvement n'est adressé au laboratoire de Mycologie, ou en cas de culture négative.

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