L’activité microbicide, une activité anti-infectieuse cruciale des polynucléaires neutrophiles est liée à la production d’espèces réactives d’oxygène (ROS). La production est déclenchée par la phagocytose. Cette activité est explorable par Cytométrie en Flux en utilisant un substrat Dihydro-rhodamine 123 (DHR123) qui devient fluorescent après réduction par les ROS. Quelques tests ont été proposés pour mesurer la production de ROS en induisant la phagocytose avec des bactéries ou des microparticules. La difficulté est de standardiser les préparations pour obtenir des résultats reproductibles en activité diagnostique. Dans cet article, nous présenterons les principes de ce test d’induction de ROS par la phagocytose d’Escherichia coli, par les phagocytes du sang périphérique, à partir d’un kit commercial standardisé mais avec quelques améliorations. Le test est direct sur sang total et la stimulation ne nécessite que 20 min d’incubation. La présence de calcium est indispensable. La production de ROS est mesurée par la fluorescence de rhodamine123, en ciblant les polynucléaires neutrophiles ou les monocytes circulants. Le test montre une forte production homogène de ROS sous stimulant chimique alors que la stimulation bactérienne a un effet plus hétérogène suivant le type cellulaire. La production par les monocytes reste faible. La capacité de production est fortement réduite chez des patients en état d’épuisement immunologique après sepsis sévère en réanimation (immuno-paralysie). Cette altération de la production est en partie liée à une baisse du pouvoir opsonisant des protéines du plasma. Le test s’avère robuste, reproductible, facile à mettre en place, rapide pour un test fonctionnel et peut permettre le dépistage de déficits primaires rares ou secondaires comme l’immuno-paralysie. Son interprétation est assez univoque.

Microbicidal activity by phagocytes is critical in protecting against bacterial or fungal infection. It is mainly due to the production or Free radical species induced by the phagocytosis. It is possible to measure directly the capacity to produce free radicles by flow cytometry (FCM) using substrates such as Dihydro-rhodamine 123 (DHR123) that become fluorescent under oxido-reduction in the presence of free radicals. This production can be triggered by bacteria or chemicals but the assay needs standardization to reach an ISO15189 accreditation level for clinical diagnosis. In this paper, we shortly describe the principle of this assay adapted from a commercial kit with some improvements. The test is directly performed on whole blood with a minimal preparation and only 20 minutes of incubation. It is calcium-dependent. As a result, CD16+ granulocytes give a straightforward response under induction by Phorbol Myristate Acetate. The response to E. coli is more heterogeneous and sometimes even stronger. Peripheral blood monocytes only give a low response. Interestingly, the response is significantly reduced in patients who had recent sever sepsis demonstrating immuno-paralysis as previously shown with other parameters. Part of this functional defect is due to a reduced opsonic activity in plasma proteins. The test appears to be robust and quite easy to be implemented in laboratory provided a minimal experience in Flow cytometry and functional tests. It is a good tool to detect primary as well as secondary deficiency in phagocytosis.