Dosage par couplage LC-MS/MS du guanidino-acétate et de la créatine urinaires : optimisation de la technique par suppression de l’étape de dérivatisation - 30/09/16
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Résumé |
Introduction |
Les syndromes de déficit en créatine regroupent trois maladies héréditaires affectant le métabolisme de la créatine : le déficit en guanidinoacétate méthyltransférase (GAMT), le déficit en arginine : glycine amidinotransférase (AGAT) et le déficit en transporteur membranaire de la créatine (CRTR).
Ces pathologies se traduisent par un déficit cérébral en créatine ayant pour conséquence une atteinte neurologique peu spécifique avec retard mental.
Le dosage du guanidinoacétate et de la créatine au niveau urinaire et plasmatique par LC-MS/MS permet de poser le diagnostic, et d’orienter vers l’un des trois déficits.
À ce jour, l’analyse de ces molécules polaires et basiques s’avère délicate. En effet pour l’étude de ces molécules peu retenues sur colonne standard, la méthode de référence requiert une étape de dérivatisation par butanol/HCl 6M rendant la technique longue et contraignante.
Pour s’affranchir de cette étape, il a été choisi d’utiliser la technique d’appariement d’ions. Le principe consiste en l’ajout, au niveau des deux phases mobiles, d’un ion de charge opposée à la molécules d’intérêt, de telle sorte qu’ils puissent ensemble former un complexe non chargé. Le contre ion, ici l’acide perfluoropentanoique, possédant une chaîne hydrophobe, va interagir via celle-ci avec la phase stationnaire organique permettant ainsi une plus forte rétention du complexe.
Matériels et méthode |
Une gamme d’étalonnage a été choisie pour couvrir les valeurs biologiques et pathologiques. Les points de gamme, les contrôles de qualité interne et les urines des patients sont diluées au 1/20 dans une solution aqueuse d’étalon interne. Après agitation et centrifugation, ils sont analysés directement par LC-MS/MS (Alliance, Quattromicro Waters).
L’utilisation de la technique d’appariement d’ions permet d’éliminer une étape de dérivatisation par estérification lente et délicate.
Pour valider la méthode, il a été choisi de suivre les recommandations du COFRAC (portée B) tout en les adaptant aux critères spécifiques des dosages réalisés par technique chromatographique.
Résultas |
Les CV intra-jours représentant la répétabilité et les CV inter-jours représentant la reproductibilité sont tous inférieurs à 15 % même pour la LOQ prouvant ainsi la fidélité de notre méthode. La justesse, évaluée par les échantillons externes de qualité, s’est avérée bonne avec des biais <15 %. Il n’a pas été noté d’effet matrice, ni de phénomène de contamination. Par ailleurs, la comparaison entre notre méthode et la méthode référence a montré des résultats sensiblement identiques. De plus, le temps de préparation des échantillons avant LC-MS/MS est passé de 2h pour l’ancienne technique à 30min par cette nouvelle méthode. Ceci correspond à un gain de temps technique de 75 % associé à une très importante simplification technique.
Conclusion |
Dans le dosage du guanidinoacétate et de la créatine par LC MS/MS, l’utilisation de l’appariement d’ions que nous avons développé permet une simplification technique de la méthode ainsi qu’un un gain de temps et apparaît donc comme une optimisation de la méthode actuelle.
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Vol 23 - N° 10
P. 1081-1082 - octobre 2016 Retour au numéroBienvenue sur EM-consulte, la référence des professionnels de santé.
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