L’hyperméthylation de l’ADN des corticosurrénalomes dans les régions promotrices des gènes (ilôts CpG) est de mauvais pronostic, de même que les mutations de quelques gènes conducteurs.

Mesurer la méthylation des îlots CpG par séquençage haut-débit. Ainsi les mutations et l’hyperméthylation seraient étudiés dans une seule expérience de séquençage (prédicteur moléculaire pronostique). Principe général : traitement de l’ADN par bisulfite, puis séquençage ; les cytosines non méthylées deviennent des thymidines, alors que les cytosines méthylées restent des cytosines.

Les séquences d’îlots différentiellement méthylés (d’après le méthylome de 45 corticosurrénalomes, Illumina 27k) sont soumises au logiciel MethPrimer, afin d’obtenir des amorces PCR n’amplifiant que l’ADN modifié par bisulfite (bisulfite-spécifique), que l’îlot soit méthylé ou non (méthyl-insensible). L’ADN tumoral est traité par bisulfite (EZ-DNA-Methylation-Gold, Epigenetics-Cie), puis amplifié (TaqGold, LifeTechnologies). Le séquençage haut débit par PGM IonTorrent (LifeTechnologies) est aligné par un programme spécifique (code R).

Trente-cinq îlots sur 55 les plus significativement hyperméthylés (d’après le méthylome) permettent le dessin de couples d’amorces PCR bisulfite-spécifiques et methyl-insensibles. Huit de ces 35 îlots ont pu être amplifiés depuis un ADN-test traité par bisulfite. Le séquençage a généré une profondeur moyenne de 4000×, aligné par notre programme spécifique. Pour chaque CpG, les C (cytosines méthylées) et les T (cytosines non méthylées) ont été comptées. L’efficacité de l’approche est confirmée sur 6 corticosurrénalomes de méthylation variable.

Le statut de méthylation d’une tumeur peut être déterminé par séquençage ciblé direct de l’ADN traité par bisulfite.